|
Ürün ayrıntıları:
|
| Ürün Adı: | qPCR | Depolama sıcaklığı: | –20 °C |
|---|---|---|---|
| cDNA sentezi için sağlam ve aktif: | 55 °C'ye kadar. | Başvuru: | PCR |
| Ses: | 1 ml | Ters transkripsiyon: | sıcaklık aralığı (42-60°C) |
| Vurgulamak: | Evrensel TaqMan Multiplex QPCR,TaqMan Multiplex QPCR Biyokimyasal Reaktif,1ml TaqMan Multiplex QPCR |
||
Evrensel TaqMan multipleks qPCR ana karışımı
Primer tasarım ilkeleri:
1. Amplifikasyon ürününün uzunluğunun 80-300 bp arasında olması önerilir;
2. Astar uzunluğu: 18-25 bp;
3. Primerlerdeki baz G+C içeriği %40-60 arasında olmalıdır;
4. İleri primerler ve ters primerler arasındaki Tm değeri farkı 2℃'den azdır ve 58-62℃ arasındaki Tm değeri en iyisidir;
5. Baz dağılımının rastgeleliği;
6. Primerler, kendi kendini tamamlayan diziler içermeseler iyi olur, aksi takdirde ikincil bir firkete yapısı oluştururlar;
7. İki primer arasında 4'ten fazla tamamlayıcı veya homolog baz olmamalıdır, aksi takdirde primer dimer oluşacak, özellikle 3' ucunda tamamlayıcı örtüşme;
8. Primerin 3' terminal tabanının G veya C olması önerilir;
9. NCBI karşılaştırma sonuçlarında spesifik olmayan başka bir ürün bulunamadı.
Evrensel TaqMan multipleks qPCR ana karışımının tanıtımı:
Bu ürün, GSK Green I kimerik floresan yöntemi kullanılarak qPCR için 2x ön karışım çözümüdür.Çekirdek bileşen olan Taq DNA Polimeraz, düşük sıcaklık koşullarında spesifik olmayan amplifikasyonu etkili bir şekilde engelleyebilen, antikor yöntemiyle bloke edilen ısıyla aktive olan bir DNA Polimerazdır.Bu arada, qPCR için optimize edilmiş reaksiyon Tamponu ile birlikte Taq DNA Polimeraz, yüksek özgüllük ve hassasiyet qPCR reaksiyonu için çok uygundur.Hedef genlerin kantitatif analizi için doğru, tekrarlanabilir ve güvenilir olan geniş bir kantitatif alanda iyi bir standart eğri elde edilebilir.Aynı zamanda bu ürün, tüm qPCR cihazlarında kullanıma uygun özel bir ROX Pasif Referans Boyası içerir ve farklı cihazlarda ROX konsantrasyonunun ayarlanmasına gerek yoktur.Numune ekleme izleyici etkisi olan premikse mavi boya eklenir ve aynı zamanda sarı şablon seyreltici sağlanır.Şablon sarı şablon seyreltici ile seyreltildiğinde ve mavi reaksiyon ön karışımına eklendiğinde, renk maviden yeşile değişir, bu da reaksiyon sistemi işleminin hazırlanmasında izleyici rolü oynayabilir ve sızıntı veya yanlış eklemeyi önleyebilir.Mavi ve sarı boyaların spektrumları, qPCR boyaları ile örtüşmez ve reaksiyon sonuçlarını etkilemez.
Hakkında Test Protokolü / ProsedürleriEvrensel TaqMan multipleks qPCR ana karışımı:
1. (Opsiyonel) şablon seyreltme:
Bu kit, sıvının rengini değiştirerek Şablonun qPCR reaksiyon sıvısına eklenip eklenmediğini doğru bir şekilde belirlemek için kullanılabilen 40 kat seyreltilmiş bir Sarı Şablon Seyreltme olan 40x SARI Şablon Seyreltme Tamponu sağlar.Örnek olarak 20ul qPCR reaksiyon sistemi alınırsa, 20ul qPCR reaksiyon çözeltisine eklenen seyreltme şablonu miktarına göre, orijinal şablonun karşılık gelen seyreltme yöntemi aşağıdaki tabloya atıfta bulunulabilir (örnek olarak 100ul'ye seyreltilmiş orijinal şablon alınır). ):
| Seyreltilmiş şablonu 20ul qPCR reaksiyon solüsyonuna(ul) ekleyin | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 40x SARI Şablon Seyreltme Tamponunu 100ul Şablon Seyreltme Sistemine(ul) ekleyin | 50 | 25 | 16.7 | 12.5 | 10 | 8.4 | 7.2 | 6.3 |
| 100ul Şablon Seyreltme Sistemini birincil şablona(ul) ekleyin | x | x | x | x | x | x | x | x |
| Nükleaz - Serbest Su (ul) ekleme hacmi | 50-x | 75-x | 83,3-x | 87.5-x | 90-x | 91.6-x | 92.8-x | 93.7-x |
Örnek:
20ul qPCR reaksiyon sistemine 2ul seyreltilmiş şablon eklenmelidir.
Örnek olarak 100ul Şablon Seyreltme sistemi alınırsa, orijinal Şablon hacmi 20ul olduğunda, 25ul 40x Sarı Şablon Seyreltme Tamponu eklenir ve ardından toplam 100ul hacme Nükleazsız Su 55ul eklenir.
40x SARI ŞABLON SEYRELTME TAMPONU artık 10x.Seyreltilmiş Şablondan 2ul'yi 20ul Seyreltme Tamponuna ekleyin ve son 40× SARI Şablon Seyreltme Tamponu 1x'tir.Sonuç olarak, Sarı Şablon Seyreltme Tamponu, nihai qPCR sisteminde 1x olmalıdır.
Evrensel TaqMan multipleks qPCR ana karışımının Ürün Bilgileri:
| Ürün adı | Ürün tanımlama | modeli |
| Evrensel TaqMan multipleks qPCR ana karışımı | GS-MBP0044-01 | 1 ml |
| GS-MBP0044-05 | 5×1 mL | |
| GS-MBP0044-15 | 15×1 mL |
Evrensel TaqMan multiplex qPCR ana karışımı ile Depolama ve İşleme Koşulları:
Islak buz torbası taşımacılığı;-20 ℃ sıcaklıkta saklanır, 12 ay geçerlidir.
Not:Şablonun seyreltilmesi gerekmiyorsa veya G3362-2'nin şablon seyrelticisi kullanılmıyorsa, bu adımı göz ardı edebilirsiniz.
2.PCR reaksiyon prosedürü (aletlere göre ayarlanabilir):
a: Amplifikasyon özgüllüğünün iyileştirilmesi gerekiyorsa, iki aşamalı prosedür veya tavlama sıcaklığı kullanılabilir;Amplifikasyon verimliliğini artırmak için üç aşamalı bir prosedür veya uzatma süresi kullanılabilir.
Not:
1. RNase kontaminasyonunu önlemek için lütfen işlem sırasında tek kullanımlık eldivenler giyin.
2. Ters transkripsiyon ürünleri kısa bir süre için -20℃'de saklanabilir.Uzun süreli depolama gerekiyorsa, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için ambalajlamadan sonra -80°C'de saklanması önerilir.
3. Şablon ökaryotik kökenliyse, en yüksek tam uzunlukta cDNA verimini elde etmek için Oligo (dT)18 Primer'in seçilmesi ve ökaryotik mRNA'nın 3' Poly A kuyruğu ile eşleştirilmesi önerilir.
4. Prokaryotik RNA'nın ters transkripsiyonu için Random Hexamer Primer veya Gene Spesifik Primer kullanılmalıdır.
5. Random Hexamer Primer geniş bir uygulanabilirliğe sahiptir ve mRNA, rRNA, tRNA, küçük RNA ve lncRNA şablonları için uygundur.
6. Ters transkripsiyonun ardından qPCR testi yapılırsa, Oligo (dT)18 Primer ve Random Hexamer Primer, mRNA'nın tüm bölgelerinde cDNA sentez etkinliğinin aynı olması için karıştırılabilir, bu da kantitatif sonuçların gerçekliğini ve tekrarlanabilirliğini geliştirmeye yardımcı olur.
7. Sonraki qPCR primerleri ekzonlar arasında tasarlanmışsa, genom çıkarma adımı atlanabilir.
Sık karşılaşılan sorunlar ve çözümleri:
| Sorun Açıklaması | Olası nedenler | Çözümler |
| Reaksiyonun sonunda amplifikasyon eğrisi görünmedi veya CT değeri çok geç ortaya çıktı | Şablon konsantrasyonu çok düşük | Şablon dilüsyonunu kat kat azaltmak için deneyi tekrarlayın ve numune konsantrasyonu bilinmediğinde en yüksek konsantrasyondan başlayın |
| Şablon bozulması | Şablon tekrar hazırlandı ve deney tekrarlandı | |
| Sistemde PCR inhibitörleri var | Genellikle kalıp taşınır, kalıbın seyreltme oranı arttırılır veya saflığı yüksek kalıp yeniden hazırlanır ve tekrarlanır. | |
| Primerler bozulabilir | Uzun süredir kullanılmayan primerler, bozulma olasılığını dışlamak için önce PAGE elektroforezi ile bütünlük açısından test edilmelidir. | |
| Düşük amplifikasyon verimliliği | primer konsantrasyonunu arttırın, üç aşamalı amplifikasyon prosedürünü deneyin veya primeri yeniden tasarlayın | |
| Amplifikasyon ürünü çok uzun | Amplifikasyon ürün uzunluğu 80-300 bp aralığında kontrol edildi | |
| Boş kontrol sinyali gösterir | Reaksiyon sistemi kirliliği | İlk olarak, kör kontrol suyu değiştirilmelidir.Aynı durum devam ederse primerler, aspiratörler ve PCR tüpleri değiştirilmeli veya yeni bir Master Mix başlatılmalıdır.Aerosol kirliliğini azaltmak için reaksiyon sistemi süper temiz bir masada hazırlanır |
| Primer dimerler gibi spesifik olmayan amplifikasyon görünüyor |
Genel olarak, amplifikasyon ürünlerinin, erime eğrisi ile analiz edilmesi gereken 35 döngüden sonra kör kontrolde görünmesi normaldir. Primeri yeniden tasarlayın, primer konsantrasyonunu ayarlayın veya PCR reaksiyon prosedürünü optimize edin |
|
| Erime eğrisinin birden fazla tepe noktası vardır | Astar tasarımı kötü | Yeni astar, astar tasarım ilkelerine göre yeniden tasarlandı |
| Primer konsantrasyonu çok yüksek | Primer konsantrasyonunu uygun şekilde azaltın | |
| cDNA şablonunda genomik kontaminasyon var | Ekstrakte edilen RNA solüsyonu, genomik kontaminasyonu gidermek veya transintron primerleri tasarlamak için DSDNase gibi DNA enzimleri kullanılarak sindirilir. | |
| Deneylerin zayıf tekrarlanabilirliği | Örnek ekleme hatası büyük |
Yüksek kaliteli emme kafası doğru pipet ile doğru pipet kullanımı; Örnekleme hatasını azaltmak için büyük hacimli şablon ekleyerek yüksek seyreltme şablonu; qPCR'nin reaksiyon hacmi büyütüldü |
| Şablon konsantrasyonu çok düşük | Şablonun seyreltme sürelerini azaltmak için deneyi tekrarlayın | |
| qPCR cihazının farklı konumlarında sıcaklık sapması | qPCR cihazını düzenli olarak kalibre edin | |
| Amplifikasyon eğrisi düzgün değil | Sistem düzeltmesinden sonra üretilen floresan sinyali çok zayıf |
Ana Karışımda önceden karıştırılan boyaların bozulmadığından emin olun; Daha iyi qPCR sarf malzemeleri toplamak için floresan sinyali değiştirin |
| Amplifikasyon eğrisi kırılmaları veya kaymaları | Şablon konsantrasyonu daha yüksekti ve temel son nokta değeri CT değerinden daha büyüktü | Temel bitiş noktası (Ct değeri -3) düşürüldü ve veriler yeniden analiz edildi |
| Bireysel Wells'in amplifikasyon eğrileri aniden keskin bir şekilde düştü | Reaksiyon tüpünde kabarcıklar var |
MIX'in tamamen çözüldüğünden ve eşit şekilde girdap ve salınım yapmadığından emin olun; Numune eklendikten sonra kabarcıklar hafif elastik ile santrifüj edilerek uzaklaştırılır. Kabarcıkları gidermek için ön denatürasyon süresi 10 dakikaya uzatıldı. |
Universal TaqMan multipleks qPCR ana karışımı hakkında daha fazla bilgiye ihtiyacınız varsa, lütfen bize çevrimiçi olarak bildirin, teşekkür ederiz.
İlgili kişi: Ms Kris
Tel: +8613049739311
